Konfokalna laserska pretražna mikroskopija
Konfokalna laserska pretražna mikroskopija (confocal laser scanning microscopy, CLSM) je metoda svjetlosne mikroskopije pomoću koje je moguće detektirati svjetlost emitiranu iz vrlo tankog sloja u uzorku. U biologiji i medicini od posebnog je značaja fluorescencijska konfokalna mikroskopija u kojoj se detektira fluorescencija u fiksiranom i obojenom uzorku, te u živim tkivima i stanicama. Što se tiče optičkih principa, razlike između klasične fluorescencijske mikroskopije i konfokalne mikroskopije su minimalne. Međutim, tehnička izvedba modernih konfokalnih mikroskopa uvodi čitav niz značajnih novina u odnosu na metodu pobuđenja, detekcije i interpretacije mikroskopske slike.
Dok se u klasičnoj fluorescencijskoj
mikroskopiji, poznatoj i pod nazivom mikroskopija širokog polja, izvor
svjetlosti koristi za istovremeno osvjetljavanje čitavog vidnog polja, u
pretražnoj mikroskopiji ono se osvjetljava točku po točku (Slika 1). U tu se svrhu pretežno koriste
laserski izvori svjetlosti, uglavnom plinski laseri, a u novije vrijeme i
laserske diode. Fokusirana laserska zraka prelazi
preko uzorka točku po točku i ondje pobuđuje fluorescentne molekule, fluorofore,
odakle i potječe termin ″pretražni″ u nazivu metode. Važno je zapamtiti da, kako
je u svakom trenutku osvijetljena samo jedna točka uzorka, nikada nije moguće
vidjeti realnu sliku čitavog vidnog polja pomoću npr. okulara, kao u klasičnoj
mikroskopiji. Slika se, bilježeći intenzitet emitirane svjetlosti točku po točku
pomoću odgovarajućeg detektora, može formirati tek u memoriji računala i biti
prikazana na zaslonu.
Najznačajnija prednost konfokalne pretražne mikroskopije sastoji se u mogućnosti
detekcije svjetlosti emitirane iz vrlo malog volumena u uzorku.
Kao prvo, korištenjem približno točkastog izvora svjetlosti, uobičajeno
fokusirane laserske zrake, ograničava se protežnost pobudne svjetlosti u
horizontalnoj ravnini uzorka. Međutim,
bitna novina konfokalne mikroskopije sastoji se u selektivnoj detekciji
emitirane fluorescencije iz tankog sloja precizno ograničenog u vertikalnom
smjeru, dakle po dubini uzorka.
Taj se učinak postiže smještanjem vrlo male aperture, tj. ušice (pinhole) u
optičku ravninu koja je konjugirana s fokalnom ravninom mikroskopskog objektiva
u uzorku. Kako se ta ravnina nalazi neposredno ispred detektora svjetlosti, kroz
ušicu prolazi samo svjetlost iz fokalne ravnine (Slika 2). Svjetlost iz ostalih,
susjednih slojeva uzorka biva blokirana aperturnim zaslonom. Kako je omogućen
prolaz svjetlosti samo iz ravnine KONjugirane FOKALnoj ravnini ušice, ova metoda
oslikavanja naziva se konfokalnom. Treba naglasiti da je glavna prednost
konfokalne mikroskopije, u odnosu na mikroskopiju širokog polja, upravo ta
selektivnost tj. mogućnost detekcije svjetlosti samo iz jedne fokalne ravnine.
Moć razlučivanja konfokalnog mikroskopa poboljšana je naprotiv tek marginalno u
odnosu na mikroskopiju širokog polja.
U praktičnoj izvedbi konfokalnih
mikroskopa najvažniji dijelovi su sklopovi za pretraživanje, tj. vođenje pobudne
i emitirane svjetlosti, tzv. skeneri, te detektori. Kao skeneri se najčešće
koriste sustavi elektronički vrlo precizno upravljanih zrcala, a kao detektori
brojači fotona, uglavnom fotomultiplikatori. Teoretska moć razlučivanja
konfokalnog mikroskopa određena je, kao i u klasičnom slučaju, kutom otvora
ulazne leće objektiva, tj. njegovom numeričkom aperturom, te valnom duljinom
fluorescentne svjetlosti. Maksimalno povećanje, međutim, nije određeno faktorom
optičkog povećanja objektiva. Ono je određeno isključivo tzv. zoom faktorom koji
se može kontinuirano podešavati i odražava veličinu rasterkog polja skenera.
Moguće je također odabrati i broj digitalnih elemenata rezultirajuće slike, tzv.
pixela, odabirom veličine, odnosno formata slike. Preporuča se ove parametre
uskladiti tako da je veličina pixela dva do tri puta manja od najmanje linearne
dimenzije koju je moguće razlučiti uz date optičke uvjete.
Iako je
potrebno uzeti u obzir moć prostornog razlučivanja konfokalnog mikroskopa, važno
je imati na umu da je vrijeme koje svaki pojedini točkasti element slike biva
osvjetljen vrlo kratko i u pravilu iznosi samo nekoliko mikrosekundi. U tom
periodu detektor je u stanju registrirati tek nekoliko desetaka emitiranih
fotona, tako da statistička svojstva brojanja fotona igraju važnu ulogu u
određivanju odnosa signala i šuma u slici. Uz određenu veličinu slike i zoom
faktor, odnos signal/šum moguće je poboljšati smanjenjem brzine skeniranja kao i
različitim metodama usrednjavanja (averaging). Treba imati na umu da se svim tim
metodama produžava vrijeme osvjetljenja svakog pojedinog pixela, a samim tim i
vrijeme potrebno za snimanje čitave slike. To je od posebne važnosti u slučaju
snimanja brzih procesa u živim stanicama. Osim takvih dinamičkih ograničenja,
vrijeme koje laserska zraka provede na određenoj točki uzorka (pixel dwell time)
potrebno je ograničiti i zbog efekata fotoizbjeljivanja i, u slučaju živih
stanica, fototoksičnosti.
U našem je laboratoriju u upotrebi konfokalni laserski pretražni mikroskop Leica TCS SP2 AOBS (Slika 3). Ovaj instrument ima dvije posebnosti koje ga izdvajaju od ostalih standardnih konfokalnih mikroskopa sličnih karakteristika. Umjesto klasičnih dikroitskih zrcala koje poznajemo iz fluorescencijske mikroskopije, ovaj instrument koristi tzv. akustooptički djelitelj snopa (Acusto-Optical Beam Splitter, AOBS). Nadalje, umjesto standardnih emisijskih filtera, ukupna svjetlost emitirana iz uzorka raspršuje se na prizmi u kontinuirani spektar i razdjeljuje na spektralna područja pomoću sustava apertura i zrcala. Radi upoznavanja s osnovnim mogućnostima tog instrumenta i uvida u korištenje softwarea pomoću kojega se upravlja mikroskopom preporučamo posjet stranici namijenjenoj korisnicima na Institutu Haartman Sveučilišta u Helsinkiju (http://www.hi.helsinki.fi/amu/AMU%20Cf_tut/index.htm).
Prostorno prikazivanje trodimenzionalnih podataka